Ambrosius wurde um 339 in Trier als Sohn des römischen Statthalters für Gallien geboren. Seine Mutter war eine überzeugte Christin. Von vielen Legenden wird die des Bienenschwarms über der Wiege des Kindes oft in Darstellungen festgehalten: Bienen fütterten dem Kind Honig in den Mund und flogen wieder davon, ohne das Kind zu verletzen, aber sie hatten ihm die "honigsüße Sprache" seiner späteren Schriften und seiner Hymnen, besonders des "Ambrosianischen Lobgesangs" (Te Deum, Großer Gott wir loben dich), vermittelt.

Nach dem Tod des Vaters zog die Familie nach Rom. Ambrosius machte nach einer umfassenden Ausbildung eine steile Karriere als Politiker.
373 wurde er von Kaiser Valentinian zum Statthalter Oberitalien. Das Volk liebte und achtete ihn, weil er Milde und Gerechtigkeit walten ließ.
374 wurde Ambrosius ob dieser Beliebtheit zum Bischof von Mailand gewählt. Ambrosius nahm an der Wahl als Beobachter der Regierung teil. Er war noch nicht getauft, lebte aber im Katechumenat, wurde getauft und eine Woche später geweiht. Seinen Besitz verkaufte er und schenkte das Geld den Armen. Ambrosius lernte Bischof zu sein. Er bemühte sich ein guter Seelsorger zu sein und kümmerte sich besonders um die Armen, zudem war ein großer Beter und konnte die Menschen mit seinen Predigten begeistern.
Energisch trat er für die Unabhängigkeit der Kirche gegenüber dem Staat auf: "Der Kaiser seht innerhalb der Kirche, nicht über ihr." war seine Rede.

391 verbot der Kaiser Theodosius auf Ambrosius' Drängen alle heidnischen Kulte und erhob das Christentum zur alleinigen Staatsreligion, womit die Anerkennung des Christentums durch Konstantin nun sogar bis zur Staatsreligion fortgeführt wurde.

Ambrosius bemühte sich dem Glaubensbekenntnis, das beim Konzil von Nicäa beschlossen worden war, zur allgemeinen Geltung zu verhelfen. Er schrieb Bibelkommentare und er war ein großer Hymnen-Dichter.

Er starb der Überlieferung nach am 4. April 397 in Mailand und wurde unter dem Hochaltar von S. Ambrogio begraben.

Als Gedenktag wird in der katholischen Kirche seit dem 11. Jahrhundert der Tag der Bischofsweihe begangen.

Dargestellt wird er mit Bienenkorb, Buch und Geißel.

Er gilt als Patron von Mailand und Bologna, der Krämer, Imker, Wachszieher und Lebkuchenbäcker; der Bienen und Haustiere, des Lernens.